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Nature Microbiology volumen 8, páginas 860–874 (2023)Citar este artículo

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Las vacunas juegan un papel fundamental en la lucha contra la pandemia de COVID-19. El control futuro de la pandemia requiere vacunas mejoradas con alta eficacia contra las variantes emergentes del SARS-CoV-2 y la capacidad de reducir la transmisión del virus. Aquí comparamos las respuestas inmunitarias y la eficacia preclínica de la vacuna de ARNm BNT162b2, la vacuna de pico vectorizado de adenovirus Ad2-pico y el candidato a vacuna de virus vivo atenuado sCPD9 en hámsters sirios, utilizando regímenes de vacunación tanto homogéneos como heterólogos. La eficacia comparativa de la vacuna se evaluó empleando lecturas de titulaciones de virus para secuenciación de ARN de una sola célula. Nuestros resultados muestran que la vacunación con sCPD9 provocó la inmunidad más robusta, incluida la eliminación viral rápida, daño tisular reducido, diferenciación rápida de preplasmablastos, respuestas humorales sistémicas y mucosas fuertes, y recuperación rápida de células T de memoria del tejido pulmonar después del desafío con SARS heterólogo. -CoV-2. En general, nuestros resultados demuestran que las vacunas vivas atenuadas ofrecen ventajas sobre las vacunas COVID-19 actualmente disponibles.

A partir de 2023, 13 vacunas COVID-19 han cumplido con los estándares para la lista de uso de emergencia (EUL) de la OMS1. Las vacunas autorizadas incluyen vacunas de subunidades y virus inactivados, vacunas de ARNm modificadas con nucleósidos y de pico vectorizado con adenovirus2. Si bien las vacunas disponibles brindan protección duradera contra enfermedades graves, la disminución de la inmunidad es evidente, en particular después de la aparición y propagación de variantes omicron3,4.

Las vacunas óptimas contra la COVID-19 protegen contra enfermedades graves, abarcan un amplio espectro de variantes del virus y previenen o limitan la transmisión del SARS-CoV-2. Las vacunas vivas atenuadas (LAV), que se han utilizado con éxito contra infecciones virales como el sarampión, las paperas y la rubéola (MMR)5, ofrecen ventajas sobre otros tipos de vacunas. No requieren adyuvantes6 y pueden administrarse localmente, por ejemplo por vía intranasal, como en el caso de los LAV de influenza7. Compuestos por virus competentes para la replicación, los LAV intranasales imitan el curso natural de la infección y la producción de antígenos, lo que los distingue de las vacunas basadas en antígenos o vectores incompetentes para la replicación administradas localmente8. A diferencia de las vacunas generadas empíricamente utilizadas en el pasado, el diseño moderno de LAV utiliza herramientas moleculares para limitar la replicación y la virulencia del virus mientras mantiene la inmunogenicidad y la integridad antigénica9. Una estrategia reciente empleada en el diseño racional de los LAV es la desoptimización de pares de codones (CPD), que es adecuada tanto para virus DNA10 como RNA11, incluido el SARS-CoV-212.

Las vacunas COVID-19 actuales se administran por vía intramuscular e inducen de manera eficiente la inmunidad sistémica, incluido un alto título de anticuerpos neutralizantes, células T de memoria central y efectora13, células T CD8+ residentes en la nariz14, células B del centro germinal15 y células plasmáticas de larga vida16. Sin embargo, esta vía es menos eficaz para inducir respuestas duraderas de IgA e IgG en la mucosa17,18 y respuestas de células de memoria residentes en el tejido pulmonar19. Los anticuerpos mucosos en el sitio de entrada del virus juegan un papel crucial en la limitación de la infectividad y la transmisión20. En consecuencia, las células de memoria residentes en tejidos experimentan respuestas de recuperación más rápidas debido al posicionamiento local y permiten un reconocimiento más temprano de antígenos afines21. Por lo tanto, se espera que las vacunas administradas por vías respiratorias proporcionen una sólida inmunidad de la mucosa local contra los patógenos específicos22. Aquí comparamos diferentes vacunas y regímenes de vacunas, evaluando la inmunidad sistémica y mucosa conferida por cada vacuna.

En un entorno de desafío heterólogo con SARS-CoV-2 Delta, evaluamos la eficacia y el modo de acción de la vacuna comercial de ARNm BNT162b2 y dos vacunas candidatas, Ad2-Spike, un vector adenoviral que lleva la glicoproteína de punta de SARS-CoV-223 y un - SARS-CoV-2 atenuado denominado sCPD924,25. Para evaluar la eficacia, los hámsters sirios se vacunaron con una dosis única (régimen de cebado únicamente) y se desafiaron con la variante Delta del SARS-CoV-2 21 días después de la vacunación. Otro grupo de hámsters recibió dos dosis de vacuna con 21 días de diferencia (régimen de sensibilización y refuerzo) y se infectaron con la exposición 14 días después del refuerzo (Fig. 1a). Todas las vacunas fueron bien toleradas, como lo demuestran las ganancias de peso constantes después de la vacunación (Datos ampliados, Fig. 1a).

a, Esquema experimental. Los hámsters sirios se vacunaron como se indica y se desafiaron con SARS-CoV-2 (1 × 105 pfu SARS-CoV-2 Delta). Los experimentos de cebado y cebado-refuerzo se realizaron de forma independiente. b, Se midieron los pesos corporales (en %) después de la exposición al virus hasta el momento del análisis y se mostraron según el grupo de vacunación. Gráfico de violín (truncado) con cuartiles y mediana. c–l, Resultados de los animales vacunados y estimulados (c–e,i,j) y resultados de los animales vacunados y estimulados (f–h,k,l): número de copias de ARN genómico (ARNg) detectado en hisopos orofaríngeos (c,f) y tejido pulmonar homogeneizado (d,g). e,h, Cuantificación del virus competente para la replicación como pfu por 50 mg de tejido pulmonar homogeneizado. La línea punteada marca el límite de detección (DL = 5 pfu). El título por debajo de los límites de detección establecidos en DL/2 = 2,5 ufp i,k, se puntuó la inflamación pulmonar, incluida la gravedad de la neumonía, la necrosis epitelial alveolar y la endotelialitis. j,l, puntuación de edema pulmonar que representa el edema perivascular y alveolar. m, las secciones del pulmón izquierdo teñidas con H&E ilustran diferentes grados de neumonía, incluidos manguitos peribronquiales y áreas consolidadas entre diferentes programas de vacunación y animales no vacunados en 5 dpc. Barra de escala, 3 mm. En los diagramas de puntos de dispersión c–e y f–h: las líneas indican medias, los símbolos representan hámsteres individuales. En i, j, k, l: las líneas centrales representan las medianas, las cajas los percentiles 25 a 75 y los bigotes los valores mínimo a máximo; los símbolos representan hámsteres individuales. En c–l, se muestran el análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. n = 5 animales por grupo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. La figura 1a se creó con BioRender.com.

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Todas las estrategias de vacunación protegieron a los hámsteres de la pérdida de peso corporal inducida por la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 1b). Después de una sola vacunación, ninguna de las vacunas previno por completo la infección por SARS-CoV-2 Delta, como lo demuestra la presencia de ARN viral en las vías respiratorias (Fig. 1c, d). Solo la vacuna sCPD9 redujo efectivamente la replicación del virus a niveles indetectables 2 días después del desafío (dpc) (Fig. 1e). La vacunación de refuerzo principal mejoró la eficacia general de la vacuna contra el SARS-CoV-2 (Fig. 1f, g). Después de la vacunación de refuerzo, el ARN viral se redujo significativamente, pero aún se puede detectar en todos los grupos en frotis orofaríngeos y pulmones. Los esquemas de vacunación que utilizan sCPD9 fueron superiores en la reducción del ARN viral (Fig. 1f, g). De manera similar, los niveles de virus competentes para la replicación en los pulmones se redujeron significativamente en los animales vacunados a los 2 dpc. Es importante destacar que solo la vacunación de refuerzo con sCPD9 redujo los niveles de replicación del virus por debajo del umbral de detección, independientemente del cebado heterólogo (ARNm) u homólogo (sCPD9) (Fig. 1h). Los resultados se confirmaron mediante la secuenciación del ARN a granel de los pulmones (Datos ampliados, Fig. 1b).

Para determinar el daño pulmonar inducido por la infección, los hámsteres desafiados fueron examinados por histopatología. Después de la vacunación única, sCPD9 fue más eficiente en la prevención de la inflamación y la neumonía, como lo demuestran las áreas pulmonares menos consolidadas (Fig. 1m) y las puntuaciones más bajas de inflamación pulmonar, bronquitis y edema (Fig. 1i,j y Datos extendidos Fig. 1c-f ). En particular, los animales que recibieron otros programas de vacunación mostraron una hiperplasia bronquial más prominente (Datos ampliados, Fig. 2). Se observó una tendencia similar para los regímenes de inducción y refuerzo; sin embargo, particularmente la vacuna de ARNm mostró un resultado histológico mejorado como resultado del refuerzo homólogo (Fig. 1k, l y Datos extendidos Fig. 1g-j). En general, la vacunación homóloga de refuerzo de sCPD9 brindó una protección pulmonar superior contra la inflamación (Figs. 1m y 2a, y Fig. 2 de datos ampliados). El análisis del transcriptoma pulmonar también mostró una amplia regulación a la baja de los genes relacionados con la infección y la inflamación en los hámsteres vacunados, con los mayores efectos observados en las vacunas sCDP9 homólogas y heterólogas (Figura 1 complementaria).

a, las secciones de pulmón teñidas con H&E a los 5 dpc del experimento de vacunación de refuerzo identificaron linfocitos perivasculares (1), edema perivascular (2), remodelación epitelial metaplásica (3), endotelialitis (4) y edema alveolar (5) según lo etiquetado por flechas numeradas, grupos como se indica. Barra de escala, 90 µm. b, Proyecciones bidimensionales de transcriptomas unicelulares utilizando una proyección de aproximación de variedad uniforme (UMAP) de células pulmonares (experimento de impulso primario). Las células están coloreadas por tipo de célula como se indica sobre la base de genes marcadores conocidos. c, d, Recuento manual de células de células pulmonares aisladas por lóbulo pulmonar (células ct), números calculados de tipos de células indicados (PMN, macrófagos monocíticos) en función de las frecuencias celulares determinadas por scRNA-seq para el experimento de estimulación primaria (c) y primer experimento (d). Gráficos de barras con media ± sem, los símbolos representan hámsters individuales (nsCPD9 = 4, nmRNA = 4, nAd2 = 4, nmock = 4, nsCPD9+sCPD9 = 3, nmRNA+sCPD9 = 3, nmRNA+mRNA = 3, nAd2+Ad2 = 3, nmock+mock = 4), ANOVA unidireccional ordinario y prueba de comparaciones múltiples de Tukey, **P < 0,01. e, Gráficos de puntos que muestran los cambios en la expresión génica en los tipos de células indicados de las cuatro estrategias de vacunación de refuerzo en comparación con los animales vacunados de forma simulada. Los genes estimulados por interferón seleccionados y las citoquinas proinflamatorias se visualizan de la siguiente manera: la coloración y el tamaño del punto indican los cambios de pliegue (FC) transformados en log2 y los valores de P, respectivamente, en animales vacunados en comparación con animales vacunados de forma simulada. Los valores de P ajustados (Padj) se calcularon mediante DEseq2 utilizando las correcciones de Benjamini-Hochberg de los valores de P de la prueba de Wald de dos caras. Los genes están ordenados por agrupamiento no supervisado. f, Localización de ARN viral por hibridación in situ en una sección longitudinal de un bronquio a 2 dpc. Señales rojas, ARN viral; azul, contratinción hemalum. Barra de escala, 30 µm.

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Para correlacionar los niveles de inflamación con las respuestas celulares, realizamos la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de muestras de pulmón (Fig. 2b y Fig. 2a complementaria). Los resultados mostraron que el reclutamiento pulmonar de macrófagos monocíticos se redujo significativamente en animales vacunados con sCPD9 + sCPD9 en 2 dpc (Fig. 2c y Fig. 2b complementaria). Se observaron efectos similares, aunque menos pronunciados, en animales que recibieron la vacunación primaria sCPD9 solo (Fig. 2d y Fig. 2c complementaria). Además, los genes estimulados por interferón inducidos por la infección por SARS-CoV-226 se redujeron ampliamente en los animales vacunados en comparación con los no vacunados, y los macrófagos monocíticos, los monocitos Treml4+ y las células endoteliales parecieron particularmente sensibles (Figura 3 complementaria). Los mediadores inflamatorios como Cxcl10 o Tnfsf10 mostraron un patrón de respuesta más uniforme en todos los tipos de células en comparación con los genes estimulados por interferón (Fig. 2e y Fig. 4a complementaria). Dado que los subtipos de macrófagos mostraron diferentes patrones de expresión génica entre los grupos de vacunación, examinamos la distribución del ARN viral dentro de los pulmones mediante hibridación in situ (Fig. 2f y Fig. 4b complementaria). En animales no vacunados, se detectó ARN viral en los pulmones, mientras que la vacunación con ARNm+ARNm redujo su aparición a parches únicos. En animales sCPD9 + sCPD9, el ARN viral era apenas detectable (Fig. 4b complementaria). En particular, en los animales ARNm + ARNm, la mayor parte del ARN viral detectable estaba presente en los macrófagos (Fig. 2f).

Para determinar las respuestas humorales, cuantificamos la capacidad de los sueros de hámster recolectados antes del desafío (0 dpc) y a los 2 y 5 dpc de hámsteres vacunados con cebado (Fig. 3a-d) y refuerzo (Fig. 3e-h) para neutralizar el SARS -Variantes CoV-2. La capacidad de los sueros de los vacunados con sCPD9 para neutralizar la variante ancestral B.1 del SARS-CoV-2 superó significativamente la de todos los demás grupos (Fig. 3a). De manera similar, los sueros sCPD9 proporcionaron una neutralización superior de las variantes preocupantes B.1.351 (Beta), B.1.617.2 (Delta) y B.1.1.529 (Omicron, BA.1) (Fig. 3b, c). Para Omicron BA.1, la capacidad de neutralización se redujo considerablemente en todos los grupos; sin embargo, la neutralización por sueros sCPD9 fue significativa (Fig. 3d). En general, la infección de desafío aumentó los anticuerpos neutralizantes con el tiempo en todos los grupos en 5 dpc (Fig. 3a-d).

a–h, Títulos de neutralización sérica de hámsteres que recibieron la vacunación principal (a–d) y principal-refuerzo (e–h) antes (0 dpc) y a los 2 o 5 dpc con SARS-CoV-2. La capacidad de neutralización se probó frente a la variante B1 (a,e), Beta (b,f), Delta (c,g) y Omicron BA.1 (d,h). El límite inferior de detección estaba en la dilución 1:8 (línea de puntos) y el límite superior en 1:2.048. Gráficos de barras con media ± sem, n = 5 por condición; en e–h, n = 10 al inicio (0 dpc), excepto en e y g donde nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 9 y en h donde nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 6, nmRNA+sCPD9 (0dpc) = 9 , nmRNA+mRNA (0dpc) = 8, nAd2+Ad2(0dpc) = 8 y nmock+mock (0dpc) = 7 debido a cantidades limitadas de suero. i, niveles de IgG específicos del SARS contra pico, ORF3a y proteína de la nucleocápside en sueros de hámsters vacunados con primo-refuerzo en los días 0 y 2 después del desafío. Los resultados se muestran como densidad óptica (DO) determinada a 450 nm. Línea central, mediana; caja, percentiles 25 a 75; bigotes, de mínimo a máximo; los símbolos indican valores individuales, nsCPD9+sCPD9 (día 0) = 6, nmRNA+sCPD9 (día 0) = 6, nmRNA+mRNA (día 0) = 7, nAd2+Ad2 (día 0) = 8, nmock+mock (día 0) = 5, nsCPD9+sCPD9 (día 2) = 5, nmRNA+sCPD9 (día 2) = 5, nmRNA+mRNA (día 2) = 5, nAd2+Ad2 (día 2) = 5 y nmock+mock (día 2) = 5 animales. Para a–i se realizaron las pruebas de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis y Dunn; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001.

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Los hámsteres reforzados con sCPD9 o la vacuna de ARNm produjeron considerablemente más anticuerpos neutralizantes que aquellos que recibieron la vacunación primaria. En general, la vacunación de refuerzo aumentó la capacidad de neutralización del suero en diferentes variantes (Fig. 3e-h). Entre las variantes probadas, Omicron BA.1 mostró la mayor capacidad para escapar de la neutralización. Solo la vacunación de refuerzo con sCPD9 proporcionó a los hámsteres una capacidad significativa para neutralizar Omicron BA.1 (Fig. 3h).

Los hámsteres vacunados con sCDP9 y mRNA + sCDP9 con refuerzo primario generaron respuestas de anticuerpos IgG significativas contra pico, ORF3a y proteína de nucleocápside (N), mientras que la IgG de hámsteres vacunados con ARNm con refuerzo primario y Ad2 solo reaccionó con proteína pico (Fig. 3i). Aunque es poco probable que los anticuerpos dirigidos contra N y ORF3a contribuyan a la neutralización del virus, la abundancia de estos anticuerpos ilustra la respuesta inmunológica más amplia provocada por la vacunación con LAV. Un título de neutralización de virus más alto en animales que se sometieron a vacunación de refuerzo (comparar Fig. 3a-d con e-h), así como una mayor reactividad anti-pico de IgG después de una infección de desafío de estos animales (Fig. 4c complementaria) sugieren un beneficio de vacunas de refuerzo.

A continuación, evaluamos las respuestas inmunitarias unicelulares de la sangre a la vacunación de refuerzo (datos ampliados, Fig. 3a). El recuento de células sanguíneas identificó densidades celulares significativamente más altas en los grupos de refuerzo vacunados con sCPD9 y Ad2 (Fig. 4a). Los números de células relativos y absolutos revelaron diferencias sustanciales entre las estrategias de vacunación (Fig. 4b y datos extendidos, Fig. 3b-d). Las frecuencias de neutrófilos maduros e inmaduros (imPMN), que aumentan particularmente en hámsteres sirios infectados con COVID-1927 grave y SARS-CoV-226, fueron más bajas para los animales vacunados con sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4b). Por el contrario, las células B, T y plasmáticas siguieron la tendencia opuesta y mostraron abundancias más altas después del régimen sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4b y Datos extendidos Fig. 3b). De acuerdo con nuestras observaciones en los pulmones, los genes relacionados con la infección y la inflamación estaban ampliamente regulados a la baja en las células mieloides de los animales vacunados (Fig. 4c y Fig. 5 complementaria).

a–e, Análisis de la composición celular y la expresión génica por scRNA-seq a 2 dpc en sangre de hámsters vacunados con prime-boost. a, Recuento manual de células por ml de sangre. b, Frecuencias de los tipos de células indicados entre las células sanguíneas. Las líneas punteadas marcan los niveles medios encontrados en hámsteres ingenuos (n = 3, datos de hámsteres ingenuos derivados y reprocesados ​​de la referencia 26). Gráficos de barras con media ± sem, n = 3. Se realizaron ANOVA unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. c, Gráficos de puntos que muestran los cambios en la expresión génica en los tipos de células indicados de las cuatro estrategias de vacunación de refuerzo en comparación con los animales vacunados de forma simulada. Los genes estimulados por interferón seleccionados y las citoquinas proinflamatorias se visualizan de la siguiente manera: la coloración y el tamaño del punto indican los valores de FC y P transformados en log2, respectivamente, en animales vacunados en comparación con animales vacunados de forma simulada. Padj fueron calculados por DEseq2 utilizando correcciones de Benjamini-Hochberg de valores de P de prueba de Wald de dos caras. Los genes están ordenados por agrupamiento no supervisado. d, Gráficos de puntos que muestran la expresión de genes marcadores de desarrollo de células B seleccionados en los subgrupos de células B de la sangre que se muestran en la Fig. 9a complementaria. El tamaño del punto representa la fracción de células en las que se detectó al menos un identificador molecular único (UMI) del gen respectivo, mientras que el color es proporcional a la expresión promedio en esas células. e, Frecuencias y números de preplasmablastos (pre-PB) identificados en el grupo 3 de células B y memoria a células en transición preplasmablastos (mem->pre-PB) identificados en el grupo 6 de células B. Gráficos de barras con media ± sem, n = 3. Se realizaron pruebas ANOVA de una vía y comparaciones múltiples de Tukey; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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Para investigar la activación de la memoria inmunitaria inducida por la vacuna, primero examinamos los transcriptomas unicelulares de las células B circulantes, centrándonos en las células B y plasmáticas de los hámsteres vacunados con la vacuna de refuerzo. La subagrupación produjo 8 poblaciones (Fig. 6a complementaria), que se asignaron a estados celulares sobre la base de genes marcadores conocidos28,29. Es de destacar que, en ausencia de información de marcadores de superficie, estas asignaciones probablemente permanezcan incompletas. En nuestro análisis, por lo tanto, nos centramos en las diferencias en los patrones de expresión génica e investigamos si una supuesta 'firma de expresión génica de recuerdo de memoria' mostraría diferencias. Primero determinamos que el grupo 8 probablemente represente plasmablastos/células plasmáticas debido a la presencia de, por ejemplo, Prdm1 (que codifica Blimp-1) o Irf4. El grupo 3 presentaba niveles intermedios de Prdm1, así como Tnfrsf17 y Tnfrsf13b. En comparación, el grupo 6 mostró niveles más altos de Pax5, Cd19, Cd27, Bach2 o Aicda y niveles más bajos de Prdm1, Xbp1 o Spib (Fig. 6b complementaria). Sobre la base de estos patrones, asumimos que estos dos grupos contendrían (pre) plasmablastos y, por lo tanto, serían más interesantes para investigar el recuerdo de la memoria. Al sondear un conjunto de genes involucrados en la regulación de las células B, encontramos una regulación positiva de Irf4, Pax5 y Tnfrsf13b/c en el grupo 3, mientras que en el grupo 6, Bach2, Irf4, Pax5 y Tnfrsf13b/c estaban regulados al alza y Aicda, Batf y Cd27 estaban regulados al alza. regulado a la baja (Fig. 4d y Fig. 6c complementaria). Esta posible 'firma de expresión génica de recuerdo de memoria' temprana fue más fuerte con la vacunación homóloga o heteróloga de refuerzo primario con sCPD9, que indujo el título de anticuerpos más alto (Fig. 3e-h). De acuerdo con esto, las células de los grupos 3 y 6 fueron significativamente más abundantes en los hámsteres vacunados con sCPD9 + sCPD9 (Fig. 4e).

Para investigar la aparición de la recuperación de la memoria de las células T, procedimos a subagrupar las células T y las asesinas naturales (NK). Con este fin, analizamos CD4 +, CD8 + y células T en proliferación en sangre (Fig. 5a, b y Figs. Suplementarias 7 y 8). Los análisis de expresión génica indicativos de proliferación (Mki67, Top2a), estado de memoria ingenua o central (Sell, Ccr7, Lef1, Il7r) y activación de células T (Cd69, Cd44, Klrg1, Icos, Cd40lg) revelaron que la mayoría de las células T sanguíneas mostraban fenotipos de memoria ingenua o central (grupo 0-4, figura complementaria 7b-e). En 2 dpc, los genes efectores de inmunidad tipo 1 (Tbx21, Gzma, Gzmb, Faslg, Ifn) solo se expresaron en células NK de sangre (grupo 5, Fig. 8 complementaria). La población de células T en proliferación consistía en células T activadas que expresaban marcadores de memoria, como Il7r (grupo 6, figura complementaria 8). Las células T proliferantes, aunque generalmente pequeñas en número, aumentaron significativamente después de la vacunación heteróloga (Fig. 5b). De acuerdo con esto, la fracción de células y el nivel de expresión de los genes asociados a la proliferación fueron más altos cuando se incluyó sCPD9 en el régimen de vacunación (Fig. 5c). Para determinar la especificidad del antígeno de las células T, vacunamos a los hámsteres con sCDP9 o ARNm y estimulamos sus esplenocitos 14 días después con la proteína recombinante SARS-CoV-2 S o N. La mancha inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISpot) de interferón gamma (IFN-γ) sirvió como lectura. La estimulación con proteína de pico indujo células secretoras de IFN-γ para ambas vacunas, mientras que tras la estimulación con proteína N, solo los esplenocitos de las vacunas sCPD9 secretaron significativamente más IFN-γ que el simulacro, lo que revela una inmunidad de células T superior y más amplia tras la vacunación con LAV (Fig. 5d ).

a–k, subconjuntos de células T por scRNA-seq (2 dpc) de hámsters vacunados con primo-refuerzo. Frecuencias y cantidades de (a) células T CD4 (grupo 0,1,2) y CD8 (grupo 3,4), y (b) células T en proliferación (grupo 6) en la sangre. Gráfico de barras con media ± sem, n = 3 para todos los grupos, excepto nmock+mock = 4. ANOVA ordinario de una vía y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. c, Gráficos de puntos que muestran la expresión de genes seleccionados en el grupo sanguíneo 6 (análisis de subgrupos T y NK en la Fig. 7a complementaria). El tamaño del punto representa la fracción de celdas con UMI > 1, el color indica la expresión. d, análisis ELISpot de IFN-γ 14 días después de la vacunación primaria. Gráfico de barras con media ± sem, n = 6, que muestra recuentos puntuales normalizados a estimulación media para cada animal, individualmente. Línea punteada, límite superior de detección (ULD). ANOVA de dos vías y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. ej., frecuencias y números de (e) células T de memoria residentes en tejidos (Trm, grupo 6), (f) células T activadas (Act T, grupo 2) y (g) células T en proliferación (células T prolif, grupo 5 + 8) en pulmones. ANOVA ordinario unidireccional y prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Gráfico de barras con media ± sem, n = 3 para todos los grupos, excepto nmock+mock = 4. En a,b,d–g: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ** ** P < 0,0001. h, gráficos de puntos que muestran la expresión de genes seleccionados en pulmones, grupos 5 y 8 (análisis de subgrupos T y NK en la figura complementaria 9a). El tamaño del punto representa la fracción de celdas con UMI > 1, el color indica la expresión. i, j, puntuación de firma del conjunto de genes Trm (refs. 28,31) en células de subgrupos de células T seleccionados en todos los grupos (i) y para grupos individuales (j), el color indica la puntuación de firma para el conjunto de genes Trm. k, puntaje de firma Trm en celdas del grupo 5. Centro, mediana; caja, percentiles 25 a 75; y bigotes, valores mínimos a máximos. Los círculos indican células individuales analizadas en el grupo 5 agrupadas de n = 3 para todos los grupos, excepto nmock+mock = 4 animales. l, PAGA. Los nodos representan grupos, los bordes representan la extensión de la conexión del grupo, el tamaño del nodo corresponde al número de celdas del grupo y el grosor de la línea es proporcional a la conectividad. m, puntuación de firma Trm (refs. 28,31) en función del rango de pseudotiempo de difusión, con una línea negra que muestra un ajuste polinomial de grado tres.

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A continuación, examinamos si las diferentes estrategias de vacunación de refuerzo diferían en la capacidad de reactivar las células T de memoria residentes en tejidos (Trm) en los pulmones30. Para caracterizar los subconjuntos de células T pulmonares, subagrupamos los grupos iniciales de células T y NK en 10 subgrupos (Fig. 9a complementaria). Sobre la base de la expresión génica de Nkg7, Cd3e, Cd4 y Cd8a, asignamos los grupos 3, 7 y 9 como células NK, el grupo 4 como células T CD8+, los grupos 0, 1, 2 y 6 como células T CD4+, y los grupos 8 y 5 como células T en proliferación (Mki67, Top2a) (Fig. 9b, c complementarias). Entre los grupos de células T CD4+, las células del grupo 2 mostraron un fenotipo mixto de marcadores de genes efectores, de activación y de memoria (Figuras complementarias 9b-e y 10a,b), y las células de los grupos 0 y 1 eran del tipo de memoria ingenua o central (Vender, Ccr7, Lef1, Il7r, Tcf7, S1pr1) (Fig. 10a complementaria). En el grupo 6, no encontramos genes asociados con firmas ingenuas o asociadas a la memoria central (Fig. 10a complementaria), sino una expresión combinada y fuerte de genes de retención de tejido y alojamiento de células T (Cxcr6, Rgs1, Prdm1, Znf683, Itga1 y Itgae), una firma indicativa del estado Trm (Figuras complementarias 10b, c y 11). Las células Trm (grupo 6) mostraron un mayor nivel de expresión génica y una fracción celular que expresaba Cxcr6, un destacado receptor de búsqueda de tejidos, en los grupos vacunados con sCPD9, mientras que el receptor de retención de ganglios linfáticos S1pr1 se detectó menos (Fig. 12a complementaria). En las células T activadas (grupo 2), la expresión génica de los genes efectores y de activación fue independiente de la vacunación previa (Fig. 12a complementaria). A los 2 dpc, las células Trm, las poblaciones de células T activadas y en proliferación eran pequeñas y representaban menos del 2% de todas las células pulmonares. Las células Trm y las células T activadas tendieron a frecuencias y números más altos en los vacunados con sCPD9 desafiados, pero solo las células T en proliferación mostraron valores significativamente más altos (Fig. 5e-g). En particular, al contrario de la proliferación de células T en la sangre, sus contrapartes pulmonares expresaron niveles más altos de Ifng y Gzma (Fig. 5h).

A continuación, calificamos los grupos de Seurat para un conjunto de genes Trm humano publicado31 y observamos un subconjunto de células en el grupo 5 (células T en proliferación) con una puntuación de firma Trm alta (Fig. 5i). En 2 dpc, la puntuación de la firma Trm en las células T en proliferación (grupo 5) fue notablemente más alta en los vacunados con sCPD9 (Fig. 5j, k). En el grupo 8 (células T en proliferación), el número total de células era demasiado bajo para generar puntajes interpretables, y no se identificaron células de animales no vacunados (Fig. 12b complementaria). Usando un enfoque de abstracción de gráficos basado en particiones (PAGA)32, identificamos una conectividad particularmente fuerte entre los grupos 2, 8 y 5, y los grupos 2 y 6, así como una posible conexión entre los grupos 6 y 8 (Fig. 5l). Ordenar las células de acuerdo con la similitud de expresión global por difusión pseudotime33 y trazar este rango contra la firma Trm corrobora aún más un camino entre los grupos 2 y 6, y los grupos 8 y 5, que se acompaña de una expresión génica variable similar a Trm (Fig. 5m y Complementario). Fig. 12c, d). En general, estos hallazgos sugieren que un subconjunto de células T en proliferación se deriva del recuerdo de Trm y se activa en respuesta a la infección por desafío de SARS-CoV-2 en hámsteres potenciados con sCPD9.

Además de la memoria potente de las células T y la inmunidad humoral, la inducción de inmunidad protectora de la mucosa es una propiedad distintiva de los LAV administrados en los sitios de entrada del virus34. Para correlacionar la inducción de la inmunidad de las mucosas con los regímenes de vacunas, medimos los niveles de IgA específicos del pico de SARS-CoV-2 y la capacidad de neutralización de los lavados nasales. Descubrimos que los animales vacunados con sCPD9 solo con cebado albergaban cantidades considerablemente mayores de IgA en lavados nasales antes y después del desafío (Fig. 6a). La infección por desafío aumentó aún más los niveles de anticuerpos IgA específicos de pico de SARS-CoV-2 en animales vacunados con sCPD9 e indujo cantidades detectables en animales vacunados con ARNm y Ad2. Los ensayos de microneutralización contra el SARS-CoV-2 (variante B.1) con lavados nasales obtenidos de animales reforzados con cebado confirmaron las mediciones de IgA. Los vacunados con sCPD9 exhibieron capacidades de neutralización marcadamente más altas a los 2 y 5 dpc (Fig. 6b). En consecuencia, identificamos linfocitos IgA positivos en la mucosa nasal de los animales vacunados (Fig. 6c). La puntuación histopatológica indicó que los animales vacunados con sCPD9 mostraron menos áreas de tejido afectado, menos daño y un reclutamiento reducido de células inmunitarias (Fig. 6d, e y Datos extendidos Fig. 4a). La vacunación con sCDP9 redujo significativamente el ARN viral en lavados nasales en comparación con el simulacro en 2 dpc (Fig. 6f), lo que se correlacionó con una señal reducida en la tinción inmunohistoquímica para la proteína N viral (Fig. 6d). Para evaluar más a fondo los efectos supuestamente beneficiosos de la inmunidad de la mucosa, recurrimos a scRNA-seq de células de tejido nasal. Primero, anotamos los tipos de células sobre la base de los genes marcadores publicados previamente (Datos extendidos Fig. 4b35). Particularmente en las células neuronales, el análisis de expresión génica diferencial mostró que los genes estimulados por interferón (Isg15, Oasl2 o Rsad2) se expresaron menos en los vacunados con sCPD9 (Fig. 6g y Fig. 13 complementaria). En particular, las respuestas de los espectadores de las células neuronales en el epitelio olfativo están relacionadas con la pérdida del olfato después de la infección por SARS-CoV-236. Además, encontramos evidencia de que la vacunación con LAV previene la transmisión del SARS-CoV-2. Después de la infección de desafío, los animales vacunados con LAV eliminan cantidades significativamente menores de virus en comparación con los individuos vacunados con ARNm. En esta configuración, la vacunación con LAV pudo prevenir la transmisión del SARS-CoV-2 mientras que la vacunación con ARNm no lo hizo (Datos ampliados, Fig. 5). En conjunto, proporcionamos evidencia de que el LAV sCPD9 brinda una protección superior contra el SARS-CoV-2 en las vías respiratorias superiores e inferiores, lo que lo convierte en un candidato prometedor para una mayor investigación en ensayos clínicos.

a, ELISA que detecta niveles de IgA anti-spike en lavados nasales de hámsters vacunados por primera vez en los puntos de tiempo indicados después del desafío (dpc). Los resultados muestran OD450. b, Capacidad de neutralización frente a B.1 de fluidos de lavado nasal de hámster vacunado con cebado-refuerzo en los puntos de tiempo indicados. Los diagramas de barras muestran la media ± sd de la prueba de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis y Dunn por punto de tiempo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Los símbolos indican hámsteres individuales, n = 5 animales por grupo. c, Tinción inmunohistoquímica de IgA en el epitelio olfativo y las glándulas submucosas a los 2 dpc. Barra de escala, 60 µm. d, Secciones histopatológicas longitudinales del epitelio olfativo, con tinción H&E (izquierda) e inmunohistoquímica de la proteína SARS-CoV-2 N (derecha) del experimento de cebado solo a 2 dpc, con una sección adicional de un tejido no infectado. e, Como en d pero para el experimento de vacunación de refuerzo. Barra de escala, 20 µm. En c-e, las imágenes son representativas de n = 5 hámsteres por grupo indicado. Los experimentos de cebado y cebado-refuerzo se realizaron de forma independiente. f, Cargas de ARN de virus detectadas en lavados nasales de hámsteres vacunados primero a los 2 y 5 dpc. En los diagramas de puntos de dispersión, las líneas indican medias, los símbolos representan hámsteres individuales. n = 5. ANOVA de dos vías y prueba de comparaciones múltiples de Tukey; *P < 0,05. g, Gráficos de puntos que muestran los cambios en la expresión génica en los tipos de células indicados de las tres estrategias de vacunación principales en comparación con los animales vacunados de forma simulada. Los genes estimulados por interferón seleccionados y las citocinas proinflamatorias se visualizan de la siguiente manera: la coloración y el tamaño del punto indican valores de FC y P transformados en log2, respectivamente, en animales vacunados en comparación con animales vacunados de forma simulada. Padj fueron calculados por DEseq2 utilizando correcciones de Benjamini-Hochberg de valores de P de prueba de Wald de dos caras. Los genes están ordenados por agrupamiento no supervisado.

Datos fuente

Las vacunas actuales contra la COVID-19 son muy eficaces para prevenir enfermedades graves; sin embargo, no se previene la infección con variantes emergentes y las cargas de virus pueden ser altas en individuos vacunados37. Para controlar la transmisión del virus y limitar la infección sintomática, se cree que la inmunidad de la mucosa en el sitio de entrada del virus es de suma importancia38,39,40.

Aquí presentamos una comparación de vacunas multiplataforma que incluye un LAV, que encontramos que provoca una protección superior contra la infección por SARS-CoV-2, especialmente en los sitios de entrada del virus en las mucosas. Esto concuerda con estudios preclínicos previos de vacunas contra la COVID-19 que utilizaron la administración intranasal de LAV, vacunas con picos basados ​​en proteínas o vectores de virus24 y una inducción eficiente de la inmunidad de las mucosas41,42,43,44. Nuestras observaciones sobre la mejora de la inmunidad inducida por la vacunación heteróloga de sensibilización y refuerzo están en línea con estudios recientes que combinan la sensibilización sistémica seguida de un refuerzo intranasal con vacunas de vectores de adenovirus o de ARNm19,45. Es importante destacar que la IgA anti-SARS-CoV-2 que neutraliza el virus en la mucosa nasal de los animales vacunados es mucho mayor en los animales vacunados con sCPD9. Es bien sabido que la IgA mucosal ejerce varias funciones, como bloquear la entrada de virus, prevenir la fusión intracelular de virus y membranas endosómicas, así como inhibir la liberación de virus de las células huésped46. La protección general contra la replicación del virus, el daño tisular y la inflamación pulmonar fue significativamente mejor en los animales vacunados con sCPD9. Al mismo tiempo, el reconocimiento de antígenos fue considerablemente más amplio en los animales que habían recibido sCPD9, y estos beneficios probablemente sean el resultado de importantes características distintivas de LAV. Estos incluyen la administración a través de la ruta natural de infección, la presentación del repertorio antigénico completo del virus y la replicación que imita al patógeno objetivo. Además, la replicación activa de los LAV puede causar una presentación prolongada y aumentada de antígenos virales en comparación con las vacunas que no se replican, un factor que podría contribuir a la mejor eficacia observada aquí. En un experimento a pequeña escala, la vacunación con LAV pudo anular la transmisión del SARS-CoV-2, mientras que la vacunación con ARNm solo tuvo efectos menores en la transmisión. El análisis scRNA-seq de muestras de sangre, pulmones y mucosa nasal de hámsters vacunados e infectados con SARS-CoV-2 reveló que, en todos los parámetros importantes, los efectos fueron más fuertes para la vacunación sCPD9 en un entorno de cebado. De manera similar, en un entorno de inducción y refuerzo, la vacunación doble con sCPD9 fue superior a la vacunación con ARNm-sCPD9, seguida de la vacunación con doble ARNm y la vacunación con doble adenovirus. Los animales vacunados con sCPD9 habían reducido sustancialmente la inducción de programas de expresión génica proinflamatoria, una característica principal de la patogénesis de COVID-1947. Esto fue específicamente cierto para las células del sistema inmunitario innato, como los monocitos y los macrófagos, que suelen tener fuertes respuestas transcripcionales proinflamatorias tras la absorción del SARS-CoV-226. Si es traducible a humanos, esto podría significar una probabilidad mucho mayor de un curso leve o asintomático de la enfermedad, incluso en el caso de infección con variantes heterólogas del SARS-CoV-2.

Además, detectamos varias firmas de expresión génica relacionadas con la activación de la memoria inmune adaptativa. El desarrollo mejorado hacia preplasmablastos derivados de células B de memoria y la proliferación mejorada de células T en la sangre de animales desafiados por scRNA-seq apuntan hacia la activación rápida de células de memoria48. También detectamos un número significativamente mayor de células T en proliferación en los pulmones de los hámsteres que recibieron sCPD9. Un subconjunto de estas células T en proliferación compartió una firma específica de Trm y mostró conectividad con el grupo de Trm identificado. Una posible explicación para esta observación es que la siembra de células T de memoria residentes en tejidos específicas del SARS-CoV-2 mejora después de la vacunación con sCPD9, lo que puede permitir respuestas de recuperación local más rápidas, caracterizadas por células T proliferantes mejoradas en los grupos de vacunas correspondientes. Los LAV imitan la infección natural, que se sabe que inducen células Th1 CD4+ específicas del SARS-CoV-2 que secretan IFN-γ49. Detectamos una regulación positiva de IFN-γ en células T pulmonares en proliferación, lo que indica que el desafío con SARS-CoV-2 desencadenó una respuesta de tipo de célula efectora Th1, y el análisis ELISpot de IFN-γ reveló reactividad multiantígena en esplenocitos de hámsteres vacunados con LAV. Si bien la inducción de IgA en la mucosa sigue siendo más importante para limitar la infección y, por lo tanto, la transmisión, las células T CD4+ de memoria de las vías respiratorias contribuyen a la protección contra otros coronavirus30 y potencialmente mejoran el repertorio antigénico reconocido en una vacuna contra el SARS-CoV-2 en la mucosa. De manera similar, estudios anteriores que utilizaron antígenos de ovoalbúmina y una combinación de diferentes vías de vacunación indicaron que no solo la IgA, sino también la inmunidad mediada por Th1 general, mejoran con la administración a través de la mucosa50.

Nuestro análisis de secuenciación de ARN unicelular tiene varias limitaciones. Esta técnica, tal como se emplea aquí, no puede capturar completamente procesos como la reactivación de células de memoria debido a la falta de marcadores de superficie y enriquecimiento específico del tipo de célula. Debido a la anotación incompleta del genoma del hámster sirio, no pudimos identificar células positivas para IgA. La calidad de los datos de las células de la mucosa nasal fue comparativamente baja debido a la difícil disociación del tejido, lo que limitó nuestras observaciones en el sitio de la infección inicial. Los datos que presentamos sobre el efecto de la vacunación en la transmisión del virus de desafío son preliminares y requieren estudios a mayor escala, el uso de variantes más recientes del SARS-CoV-2 y análisis de mecanismos para su validación. Si bien nuestros datos muestran superioridad y, por lo tanto, prometen un mayor desarrollo y refinamiento de los LAV, existe una advertencia para extrapolar los resultados de los ensayos preclínicos con animales a la situación en humanos. Claramente, los estudios clínicos sobre la seguridad y la eficacia de las vacunas vivas atenuadas tienen el mandato de evaluar de manera realista el potencial de estas vacunas para combatir la pandemia aún en curso.

Un problema con los LAV es su susceptibilidad potencial a la inmunidad previamente establecida51, lo que restringiría la replicación del virus de la vacuna y podría limitar su uso como refuerzo después de la inmunización inicial mediante vacunación o infección natural. Mostramos aquí que sCPD9 estimula eficazmente las respuestas inmunitarias y mejora en gran medida la protección cuando se aplica tres semanas después de la vacunación inicial. Es importante destacar que sCPD9 mejora las respuestas inmunitarias humorales, especialmente contra variantes de escape inmunitario conocidas como Beta y Omicron BA.1, al tiempo que mejora el resultado virológico de una infección de desafío heteróloga cuando se aplica como refuerzo tres semanas después de la vacunación inicial. Esto indica un amplio margen para el uso de LAV en poblaciones que exhiben un alto grado de inmunidad inicial inducida por vacunación o infección previa.

Debido a su alto perfil de seguridad, sCPD9 fue degradado recientemente del nivel de bioseguridad (BSL) 3 a BSL 2 por la autoridad estatal alemana pertinente52. Este es un paso clave hacia la aplicación clínica de un LAV de SARS-CoV-2, ya que facilitará la producción de una vacuna de grado clínico y facilitará en gran medida los ensayos clínicos en humanos.

El trabajo in vitro y con animales se realizó en condiciones de bioseguridad apropiadas en una instalación BSL-3 en el Institut für Virologie, Freie Universität Berlin, Alemania. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, nacionales e internacionales pertinentes para el cuidado y uso humanitario de los animales y fueron aprobados por la autoridad estatal competente, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania (permiso número 0086/20).

Se cultivaron en medio mínimo esencial (MEM) que contiene suero fetal bovino al 10 %, 100 UI ml−1 de penicilina G y 100 µg ml−1 de estreptomicina a 37 °C y 5 % de CO2. Además, el medio de cultivo celular para células Vero E6-TMPRSS2 contenía 1000 µg ml−1 de geneticina (G418) para garantizar la selección de células que expresan los genes de resistencia a neomicina y TMPRSS2.

El mutante de SARS-CoV-2 atenuado vivo modificado sCPD9 y SARS-CoV-2 variantes B.1 (BetaCoV/Munich/ChVir984/2020; B.1, EPI_ISL_406862), Beta (B.1.351; hCoV-19/Netherlands/ NoordHolland_20159/2021) y Delta (B.1.617.2; SARS-CoV-2, Human, 2021, Germany ex India, 20A/452R (B.1.617)) se propagaron en células Vero E6-TMPRSS2. Omicron BA.1 (B.1.1.529.1; hCoV-19/Alemania/BE-ChVir26335/2021, EPI_ISL_7019047) se propagó en células CaLu-3. Todas las reservas de virus se secuenciaron con el genoma completo antes de los experimentos de infección para confirmar la integridad genética en la mayoría de la población, específicamente en el sitio de escisión de la furina. Antes de la infección experimental, las reservas de virus se almacenaron a -80 °C.

Se compraron hámsteres sirios (Mesocricetus auratus; raza RjHan:AURA) de nueve a 11 semanas de edad de Janvier Labs y se alojaron en grupos de 2 a 3 animales en jaulas con ventilación individual. Los hámsters tenían libre acceso a comida y agua. Se les permitió acostumbrarse a las condiciones de alojamiento durante 7 días antes de la vacunación. Para ambos experimentos, las temperaturas de las jaulas se mantuvieron en un rango constante de 22 a 24 °C con una humedad relativa entre 40 y 55 %.

Para los experimentos de infección, los hámsteres sirios se asignaron aleatoriamente a grupos, con 50 a 60% de los animales en cada grupo siendo hembras. En el primer experimento, 15 hámsteres fueron vacunados de forma simulada o vacunados con virus sCPD9 vivo atenuado, pico de Ad2 o ARNm. La vacunación con sCPD9 se aplicó mediante instilación intranasal bajo anestesia (1 × 105 unidades formadoras de focos (ffu), 60 µl)53. Ad2-spike (5 × 108 unidades infecciosas, 200 μl) y vacuna de ARNm (5 μg de ARNm, 100 μl) se aplicaron por vía intramuscular. Los hámsteres vacunados de forma simulada se vacunaron mediante instilación intranasal con sobrenadante de cultivo celular estéril obtenido de células Vero E6-TMPRSS2 no infectadas. A los 21 días después de la vacunación, los hámsteres se infectaron con la variante SARS-CoV-2 Delta (1 × 105 unidades formadoras de placas (ufp), 60 µl) mediante instilación intranasal bajo anestesia. En el segundo experimento, 10 hámsters fueron vacunados de forma simulada o vacunados con una de las tres vacunas (ver arriba) seguido de una vacunación de refuerzo 21 días después. A los 14 días después de la vacunación de refuerzo, los hámsteres se expusieron como se describe anteriormente.

Para determinar la transmisión posterior del virus de desafío en individuos vacunados, vacunamos a 3 animales por grupo en un régimen de refuerzo. Con este fin, los hámsteres recibieron 1 × 104 ffu sCPD9delFCS en 60 μl de MEM por vía intranasal, 5 μg de ARNm de BNT162b2 en 100 μl de solución salina normal (0,9 % de NaCl en agua esterilizada) por vía intramuscular o 60 μl de MEM simple por vía intranasal (simulacro). La vacunación se reforzó usando las mismas vacunas para cada grupo respectivo 21 días después de la vacunación inicial.

Los hámsteres vacunados se infectaron con 1 × 105 pfu de la variante B.1 del SARS-CoV-2 como se describió anteriormente. A las 24 h después de la infección, los hámsters vacunados infectados se pusieron en contacto con animales no expuestos y cohabitaron para monitorear la transmisión durante 6 días consecutivos. Se obtuvieron hisopos orales diarios de cada animal para monitorear la diseminación y transmisión del virus.

sCPD9 se cultivó en células Vero E6-TMRSS2 y se tituló en células Vero E6 como se describió anteriormente; los títulos finales se ajustaron a 2 × 106 ffu ml−1 en MEM. Se generó pico de Ad2 recombinante, se produjo en células 293T y se purificó como se describió previamente23. BNT162b2 se obtuvo como producto comercial (Comirnaty) y se manipuló exactamente como recomienda el fabricante, excepto que la concentración final de ARNm se ajustó a 50 µg ml−1 (100 µg ml−1 es la concentración recomendada para uso en humanos) mediante agregando solución salina para inyección (0,9 % de NaCl en agua estéril) inmediatamente antes de su uso.

Para aumentar la estabilidad genética de la construcción sCPD9, se eliminó el sitio de escisión de furina (FCS) de la proteína de pico para crear sCPD9delFCS. Este virus de la vacuna con FCS eliminado solo se usó para el estudio de transmisión de este documento (Datos extendidos Fig. 5). Es importante destacar que todas las vacunas utilizadas en este estudio contienen el mismo antígeno de pico de SARS-CoV-2 derivado de la secuencia ancestral B.1 (Wuhan).

Se administró sCPD9 por vía intranasal bajo anestesia general (0,15 mg kg-1 de medetomidina, 2,0 mg kg-1 de midazolam y 2,5 mg kg-1 de butorfanol) a una dosis de 1 × 105 uff por animal en un volumen total de 60 µl de MEM. Para los experimentos de transmisión (Datos extendidos Fig. 5), se aplicó 1 × 104 ffu sCPD9delFCS de la misma manera. El pico de Ad2 se inyectó por vía intramuscular a 5 × 10 ^{8} unidades infecciosas en 200 \mu l de tampón de inyección (KCl 3 mM, MgCl _{2} 1 mM, glicerol al 10 % en PBS). Se inyectó BNT162b2 por vía intramuscular a una dosis de 5 µg de ARNm por animal en 100 µl de solución salina fisiológica (0,9% de NaCl en agua estéril).

Se obtuvieron lavados nasales de cada hámster en este estudio. Con este fin, el cráneo de cada animal se dividió ligeramente paramedial, de manera que el tabique nasal permaneció intacto en un lado de la nariz. Posteriormente, se deslizó con cuidado una punta de pipeta de 200 µl por debajo del tabique nasal y se aplicaron 150 µl de líquido de lavado (PBS con 30 µg ml−1 de ofloxacina y 10 µg ml−1 de voriconazol). El lavado se recogió a través de la fosa nasal y el procedimiento de lavado se repitió dos veces; se recuperaron aproximadamente 100 µl de muestra después del tercer lavado.

Los lavados nasales obtenidos del ensayo de vacunación de cebado solo se sometieron a un análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de anticuerpos IgA específicos de pico de SARS-CoV-2. Los lavados nasales obtenidos del ensayo de vacunación prime-boost se utilizaron para el ensayo de microneutralización para evaluar su capacidad para neutralizar la variante ancestral B1 del SARS-CoV-2.

Para la cuantificación del virus competente en replicación, se usaron 50 mg de tejido pulmonar. Se prepararon diluciones seriadas de 10 veces después de homogeneizar las muestras de órganos en un molino de perlas (Analytic Jena). Las diluciones se cultivaron en placas de células Vero E6 cultivadas en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 2,5 horas a 37 °C. Posteriormente, las células se cubrieron con MEM que contenía carboximetilcelulosa sódica al 1,5 % (Sigma Aldrich) y se fijaron con solución de formaldehído al 4 % 72 h después de la infección. Para contar las unidades formadoras de placas, las placas se tiñeron con azul de metileno al 0,75 %.

Los pulmones se procesaron como se describió previamente53. Después de la extracción cuidadosa del lóbulo pulmonar izquierdo, el tejido se fijó en solución de formaldehído al 4% tamponada con PBS (pH 7,0) durante 48 h. Para la preparación de los cornetes, se fijaron en consecuencia partes de la mitad izquierda del cráneo. Posteriormente, los pulmones o los cornetes se retiraron suavemente de la cavidad nasal y se incluyeron en parafina, se cortaron a 2 µm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). La hibridación in situ en los pulmones se realizó como se describió anteriormente54 utilizando el kit de ensayo de tejido ViewRNA ISH (Invitrogen by Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con ajustes menores. Para la localización del ARN del SARS-CoV-2, se utilizaron sondas que detectan secuencias del gen N (base de datos NCBI NC_045512.2, nucleótidos 28,274–29,533, ID de ensayo: VPNKRHM). La unión específica de secuencia se controló usando una sonda para la detección de neumolisina. La inmunohistoquímica en los cornetes se realizó como se describió anteriormente 55 (detalles en Métodos complementarios).

El análisis microscópico cegado fue realizado por un patólogo veterinario (JB) certificado por la junta.

Se realizó un ELISA interno para investigar los niveles de IgG específicos del SARS en suero y los niveles de IgA específicos del SARS en lavados nasales después de la vacunación (detalles en Métodos complementarios).

Para evaluar la capacidad de los lavados nasales obtenidos del ensayo de vacunación de refuerzo para neutralizar el SARS-CoV-2 auténtico (B.1), los lavados nasales se diluyeron 1:1 en 2x MEM que contenía 50 µg ml−1 de enrofloxacina y 10 µg ml−1 de voriconazol. Se realizaron diluciones en serie posteriores en MEM que contenía 25 mg ml-1 de enrofloxacina, 5 µg ml-1 de voriconazol y 1% de FBS. Se añadió SARS-CoV-2 (50 pfu) a las diluciones de lavado nasal y diluciones de 1:2 a 1:256 se colocaron en placas en células Vero E6 casi confluentes sembradas en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Tres días después de la inoculación, las células se fijaron y tiñeron con azul de metileno. Para identificar las diluciones neutralizantes de virus, se evaluó la integridad de la monocapa celular comparándola con pocillos de control que no contenían lavado nasal o virus. La última dilución sin evidencia de efecto citopático inducido por virus se consideró el título neutralizante para la muestra respectiva.

Se analizaron muestras de suero para determinar su capacidad para neutralizar diferentes variantes de SARS-CoV-2. Las muestras del día 0 de la prueba de refuerzo principal no se pudieron analizar para detectar anticuerpos neutralizantes contra B.1.351 (Beta) debido a la falta de material. Los sueros se inactivaron a 56 °C durante 30 min. Se sembraron diluciones seriadas dobles (1:8 a 1:1,024) en placas de 96 pocillos y se pipetearon 200 ufp de SARS-CoV-2 en cada pocillo. Después de un tiempo de incubación de 1 h a 37 °C, las diluciones se transfirieron a placas de 96 pocillos que contenían células Vero E6 subconfluentes y se incubaron durante 72 h a 37 °C (B.1, Beta, Delta) o durante 96 h a 37 °C (Omicrón). Las placas se fijaron con solución de formaldehído al 4% y se tiñeron con azul de metileno al 0,75%. Los pocillos que no mostraron efecto citopático se consideraron neutralizados.

El análisis ELISpot de IFN-γ de hámster se realizó como se describió anteriormente56. En resumen, se utilizó el kit ELISpotBASIC de IFN-γ de hámster (MABTECH) para detectar la secreción de IFN-γ por 5 × 105 esplenocitos aislados, cada uno en cocultivo con diferentes estímulos. Los esplenocitos tratados con medio sirvieron como control negativo y se usó ovoalbúmina recombinante (10 mg ml-1) como estímulo de control negativo de proteína. La estimulación general de las células T se logró utilizando 5 μg ml−1 de concanavalina A (ConA, Sigma Aldrich). Proteína de pico de SARS-CoV-2 (2019-nCoV) recombinante (S1 + S2 ECD, etiqueta His; 10 mg ml−1; Sino Biological Europe) o nucleocápside de SARS-CoV-2 (2019-nCoV) recombinante de 10 mg ml−1 La proteína (N) (Sino Biological Europe) se utilizó para volver a estimular las células T específicas del SARS-CoV-2. Los puntos se contaron utilizando un escáner Eli.Scan ELISpot (AE.L.VIS) y el software de análisis ELI.Analyse v5.0 (AE.L.VIS).

Para cuantificar las copias genómicas en hisopos orofaríngeos y 25 mg de tejido pulmonar homogeneizado, se extrajo el ARN con el kit innuPREP Virus DNA/RNA (Analytic Jena) según las instrucciones del fabricante. La qPCR se realizó con el kit NEB Luna Universal Probe One-Step RT–qPCR (New England Biolabs) con condiciones de ciclo de 10 min a 55 °C para la transcripción inversa, 3 min a 94 °C para la activación de la enzima y 40 ciclos de 15 s a 94 °C y 30 s a 58 °C en un ciclador qTower G3 (Analytic Jena) en placas de 96 pocillos qPCR selladas. Se usaron cebadores y sondas como se informó previamente57. Oligonucleótidos (Secuencia (5'-3')): E_Sarbeco_F: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT;

E_Sarbeco_R: ATATTGCAGCAGTACCGCACACA;

E_Sarbeco_P1: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ.

Para la cuantificación de la expresión génica, utilizamos el ensamblaje y la anotación del genoma MesAur 2.0 disponible a través de la base de datos del genoma del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/11998?genome_assembly_id=1585474). El archivo GFF se convirtió a GTF usando gffread 0.12.758. Cuando no se produjeron superposiciones, las 3'-UTR en la anotación se ampliaron en 1000 pb como se describió anteriormente59. Los pasos de pulido adicionales para el archivo GTF se describen en la página de GitHub que acompaña a este documento (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and -inmunidad-sistémica-al-SARS-CoV-2). El archivo gtf final utilizado para el análisis está disponible a través de GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596).

Para realizar la secuenciación masiva de ARN, se aisló el ARN del tejido pulmonar utilizando el reactivo Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion, Life Technologies). Brevemente, se añadió 1 ml de Trizol a la muestra de órgano homogeneizada y se agitó en el vórtex a fondo. Después de un tiempo de incubación de 20 min, se añadieron 200 µl de cloroformo. Las muestras se agitaron nuevamente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C y se transfirieron 500 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo que contenía 10 µg de GlycoBlue. Se añadió isopropanol (500 µl), seguido de agitación vorticial, incubación y centrifugación de las muestras como se describe anteriormente. Posteriormente, se eliminó el isopropanol y se aplicó 1 ml de etanol (75%). Los tubos se invirtieron brevemente y se centrifugaron a 8000 × g durante 10 min. Después de liberar el precipitado de etanol, el ARN se resuspendió en 30 µl de agua libre de ARNasa y se almacenó a -80 °C.

Los glóbulos blancos se aislaron de sangre con EDTA como se describió previamente; los pasos incluyeron la lisis de glóbulos rojos y la filtración de células antes del conteo. Las células pulmonares (lóbulo caudal) se aislaron como se describió previamente26,60; los pasos incluyeron digestión enzimática, disociación mecánica y filtración antes de contar en azul de tripán. Los tampones contenían 2 µg ml-1 de actinomicina D para evitar la transcripción de novo durante los procedimientos.

Para obtener suspensiones unicelulares de la mucosa nasal de hámsters desafiados con SARS-CoV-2, el cráneo de cada animal se dividió ligeramente paramedial para que el tabique nasal permaneciera intacto en el lado izquierdo de la nariz. El lado derecho de la nariz se extrajo cuidadosamente del cráneo y se almacenó en PBS 1x enfriado con hielo con BSA al 1% y 2 µg ml-1 de actinomicina D hasta su uso posterior. Las partes de la nariz se transfirieron a 5 ml de solución Corning Dispase complementada con 750 U ml-1 de colagenasa CLS II y 1 mg ml-1 de DNasa, y se incubaron a 37 °C durante 15 min. Para la preparación de células de la mucosa nasal, los cornetes se retiraron cuidadosamente de la cavidad nasal y se volvieron a incubar en medio de digestión durante 20 min a 37 °C. El tejido de la concha se disoció pipeteando y presionando a través de un filtro de 70 µm con un émbolo. Se añadió PBS helado con BSA al 1 % y 2 µg ml−1 de actinomicina D para detener la digestión enzimática. La suspensión celular se centrifugó a 400 × g a 4 °C durante 15 min y se descartó el sobrenadante. Las células nasales sedimentadas se resuspendieron en 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 min. La reacción de lisis se detuvo con PBS 1x con BSA al 0,04 % y las células se centrifugaron a 400 × g a 4 °C durante 10 min. Las células sedimentadas se resuspendieron en PBS 1x con BSA al 0,04 % y se filtraron a 40 µm. Las células vivas se contaron en azul de tripano y se determinaron las tasas de viabilidad utilizando una cámara de recuento. La concentración de células para scRNA-seq se ajustó por dilución.

Las células aisladas de la sangre, los pulmones y las cavidades nasales de los hámsteres sirios se sometieron a scRNA-seq utilizando el sistema de expresión génica 3' de células únicas de cromo 10x Genomics con tecnología de códigos de barras para la multiplexación de células (detalles en Métodos complementarios).

Las lecturas de secuenciación se procesaron inicialmente con bcl2fastq 2.20.0 y el comando múltiple del software Cell Ranger 6.0.2. Para la demultiplexación de cellplex, los umbrales de asignación se ajustaron parcialmente (para obtener detalles, consulte la página de GitHub en https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior- inmunidad mucosal y sistémica al SARS-CoV-2). Se realizó un procesamiento adicional en el paquete R 4.0.4 Seurat R 4.0.661, así como en los paquetes R ggplot2 3.3.5, dplyr 1.0.7, DESeq2 1.30.1, lme4 1.1–27.1 y dependencias, y en Python 3.9.13 como así como paquetes de Python scanpy 1.9.1, scvelo 0.2.4 y dependencias. En el siguiente paso, las células se filtraron por un umbral de calidad flexible (mínimo de 250 genes detectados por célula) y se agruparon. Luego, los tipos de celda se anotaron por grupo y se filtraron utilizando umbrales específicos del tipo de celda (se eliminaron las celdas por debajo de la mediana o en el cuartil más bajo dentro de un tipo de celda). Las celdas restantes se procesaron utilizando SCT/flujo de trabajo integrado62 y los tipos de celda se anotaron nuevamente en el objeto Seurat resultante. Todo el código para el análisis posterior está disponible en GitHub en https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to- SARS-CoV-2.

Los detalles sobre el análisis estadístico de los datos de secuenciación, incluidos los pasos de preprocesamiento, se describen en la sección Métodos individuales. Los análisis virológicos, histopatológicos, ELISA, las frecuencias celulares y las estadísticas del número de células se realizaron con GraphPad Prism 9. Los detalles estadísticos se proporcionan en las leyendas de las figuras respectivas. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Se asumió que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. No se excluyeron datos de los análisis. Todos los experimentos con animales vivos se aleatorizaron, los demás experimentos no se aleatorizaron. Los investigadores desconocían la asignación de hámsteres durante los experimentos con animales y la evaluación de resultados primarios (desarrollo clínico, titulaciones de virus, qPCR, ELISpot, serología e histopatología). Los investigadores no estaban cegados a la asignación en otros experimentos y análisis.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación sin procesar están disponibles en GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596), junto con tablas de recuento de lecturas de secuencias de ARN a granel y matrices h5 y Seurat objetos para los datos de scRNA-seq. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código está disponible en GitHub en https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to-SARS-CoV- 2.

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Descargar referencias

Agradecemos a VM Corman de Charité por su ayuda en el diseño del estudio y los debates prolíficos sobre los resultados y las conclusiones; S. Reiche (Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Alemania) por proporcionar el anticuerpo contra la nucleocápside anti-SARS-CoV-2; C. Thöne-Reineke por su apoyo en el bienestar y la cría de animales; y el Archivo Europeo de Virus, D. Bourquain (Robert-Koch-Institut, Berlín, Alemania) y C. Reusken (Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente, Bilthoven, Países Bajos) por proporcionar las variantes del SARS-CoV-2 utilizadas en este estudio . Las células Vero E6-TMPRSS2 fueron proporcionadas por NIBSC Research Reagent Repository, Reino Unido, gracias a M. Takeda. El financiamiento fue proporcionado por: el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea - subvención EVA-GLOBAL 871029; Beca Deutsche Forschungsgemeinschaft OS 143/16-1 (NO); subvención Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR84, subproyecto Z01b (JT, ADG); Subvención Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB TR84, subproyecto C06 y C09 (MW); Subvención Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1449–431232613, subproyecto B02 (MW, GN); Bundesministerium für Bildung und Forschung - Subvención MAPVAP 16GW0247 (GN, MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung - Subvención Organo-Strat 01KX2021 (ADG); Bundesministerium für Bildung und Forschung - subvención e:Med CAPSyS 01ZX1604B (MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung - e:Med SYMPATH grant 01ZX1906A (MW); Bundesministerium für Gesundheit – Subvención CHARIS 6a (MDM); Subvención 3R de la Fundación Einstein EZ-2020-597 FU (ADG); Fondo de Iniciativas y Redes de la Asociación Helmholtz - Beca COVIPA KA1-Co-02 (GTA, ML, EW); y una subvención Charité 3R (PP, CG). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por Freie Universität Berlin.

Estos autores contribuyeron igualmente: Geraldine Nouailles, Julia M. Adler.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Emanuel Wyler, Dusan Kunec, Jakob Trimpert.

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Medicina Respiratoria y Cuidados Críticos, Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Geraldine Nouailles, Julia M. Adler, Peter Pennitz, Morris Baumgardt, Cengiz Goekeri y Martin Witzenrath

Instituto de Virología, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Julia M. Adler, Christine Langner, Ricardo Martin Vidal, Na Xing, Azza Abdelgawad, Nikolaus Osterrieder, Dusan Kunec y Jakob Trimpert

Institute of Pathology Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, e Institute for Biology, IRI Life Sciences, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Stefan Peidli y Nils Blüthgen

Instituto de Biología de Sistemas Médicos de Berlín (BIMSB), Centro Max Delbrück de Medicina Molecular de la Asociación Helmholtz (MDC), Berlín, Alemania

Luiz Gustavo Teixeira Alves y Emanuel Wyler

Instituto de Patología Animal, Universidad Libre de Berlín, Berlín, Alemania

Judith Bushe, Anne Voss, Alina Langenhagen y Achim D. Gruber

Instituto de Virología, Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Fabian Pott, Julia Kazmierski, Daniela Niemeyer, Christian Drosten y Christine Goffinet

Instituto de Salud de Berlín (BIH), Berlín, Alemania

Fabian Pott, Julia Kazmierski y Christine Goffinet

Pruebas de productos de IVMP, División de Medicamentos Veterinarios, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Alemania

Aileen Ebenig, Mona V. Lange y Michael D. Mühlebach

Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF), sitio asociado Gießen-Marburg-Langen, Giessen, Alemania

Michael D. Mühlebach

Facultad de Medicina, Universidad Internacional de Chipre, Nicosia, Chipre

Gengis Goekeri

Instituto de Fisiología, Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Szandor Simmons

Departamento de Ginecología, Charité - Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Susanne Herwig y Gunter Cichon

Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF), sitio asociado Charité, Berlín, Alemania

Daniela Niemeyer y Christian Drosten

Instituto de Biología de Sistemas Médicos de Berlín (BIMSB) Centro Max Delbrück de Medicina Molecular de la Asociación Helmholtz (MDC) e Instituto de Biología, Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

marcus landthaler

Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Chongqing, Chongqing, China

haibo wu

Instituto de Salud de Berlín en Charité, Universitätsmedizin Berlin, Berlín, Alemania

Samantha D. Praktiknjo

Departamento de Enfermedades Infecciosas y Salud Pública, Jockey Club College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Kowloon, Hong Kong, China

Nicolás Osterrieder

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DK y JT conceptualizaron el proyecto. GN, JMA, PP, SP, GTA, MB, JB, AV, AL, FP, JK, C. Goekeri, DN, HW, SDP, EW, DK y JT desarrollaron la metodología. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, AE, MVL, MDM, SS, NX, CL, RMV, AA, SH, HW, ADG, SDP, EW, DK y JT realizaron las investigaciones. GN, JMA, PP, SP, GTA, JB, AV, AL, SDP, EW, DK y JT realizaron visualización. GN, GC, ADG, C. Goffinet, MW, DN, CD y JT recursos adquiridos. NO y JT obtuvieron financiación. JT administró el proyecto. GN, GC, CD, C. Goffinet, ML, NB, MW, ADG, SDP, NO, DK, EW y JT supervisaron el proyecto. GN, JMA, EW, DK y JT escribieron el borrador original. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Jakob Trimpert.

En relación con este trabajo, Freie Universität Berlin ha presentado una solicitud de patente (FU227EP - 22193939.0- 1111, Freie Universität Berlin, Alemania) para el uso de sCPD9 como vacuna en humanos. En esta solicitud, JT, NO y DK se nombran como inventores de sCPD9. Freie Universität Berlin está colaborando con RocketVax Inc. para un mayor desarrollo de sCPD9 y recibe fondos para la investigación. Independientemente de este trabajo, GN ha recibido financiación para proyectos de Biotest AG; y MW recibieron fondos para investigación de Bayer Health Care, Biotest, Pantherna y Vaxxilon, y para conferencias y asesoramiento de Alexion, Aptarion, Astra Zeneca, Bayer Health Care, Berlin Chemie, Biotest, Boehringer Ingelheim, Chiesi, Glaxo Smith Kline, Insmed, Novartis, Teva y Vaxxilon. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Microbiology agradece a Duane Wesemann y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a) Se midió el desarrollo del peso corporal en porcentaje de los hámsteres vacunados durante 21 días hasta el momento del desafío del virus y se mostró según el grupo de vacunación. Gráfico de violín (truncado) con cuartiles y mediana. (b) Experimento de refuerzo: expresión relativa de las transcripciones de ARNm virales que abarcan la unión canónica total de SARS-CoV-2, en comparación con las transcripciones genómicas totales, generadas después del análisis de secuenciación de ARN a granel a partir de tejido pulmonar homogeneizado. Los valores se muestran en escala log10 para ambos puntos de tiempo analizados. Diagrama de puntos de dispersión con media. ANOVA de dos vías (análisis de varianza) y prueba de comparación múltiple de Tukey. (c – j) Puntuación semicuantitativa de los hallazgos histopatológicos de los hámsteres sirios incluidos en el ajuste principal (c – f) y de refuerzo principal (g – j): (c, g) Se muestra el área pulmonar consolidada encontrada en el lóbulo pulmonar izquierdo en porcentaje ( d, h ) La puntuación de bronquitis explica la gravedad de la necrosis epitelial bronquial y la bronquitis. (e, i) Para considerar la respuesta inmunitaria celular local, se evaluó la infiltración pulmonar de neutrófilos, linfocitos y macrófagos en la puntuación de entrada de leucocitos. (f, j) La extensión de la endotelialitis en el lóbulo pulmonar izquierdo se indica en la puntuación de endotelialitis. (c – j) Los resultados se muestran como gráficos de centro (mediana), caja (percentil 25 a 75) y bigotes (mín. a máx.). ANOVA de dos vías y prueba de comparación múltiple de Tukey. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 y ∗∗∗∗p < 0,0001. (b – j) n = 5 hámsteres individuales para todos los grupos. Los experimentos de cebado y cebado-refuerzo se realizaron de forma independiente.

Datos fuente

Histopatología representativa de secciones de pulmón teñidas con hematoxilina y eosina de experimentos de vacunación de solo cebado y refuerzo de cebado en 5 dpc. Las imágenes son representativas de n = 5 hámsteres por grupo indicado. Los experimentos de cebado y cebado-refuerzo se realizaron de forma independiente. Para ambos experimentos, las columnas muestran, de izquierda a derecha, bronquitis, neumonía que afecta los alvéolos respiratorios y vasos sanguíneos con endotelialitis. En el enfoque de solo cebado, y en contraste con todos los demás grupos que desarrollaron bronquitis hiperplásica y necrosupperative, solo los hámsteres vacunados con sCPD9 tenían bronquitis insignificante en presencia de infiltración subepitelial similar a BALT con linfocitos y células plasmáticas. En los pulmones, los alvéolos de los animales vacunados con sCPD9 presentaban un parénquima respiratorio mucho menos consolidado, con menos macrófagos y neutrófilos infiltrantes. Solo los animales vacunados con Ad2 y con la vacuna simulada desarrollaron una marcada remodelación metaplásica alveolar, lo que indica una regeneración después de la necrosis del epitelio alveolar. La endotelialitis fue más leve en todos los grupos vacunados en comparación con los animales vacunados de forma simulada. En los experimentos de estimulación primaria, la bronquitis hiperplásica fue más leve en los hámsteres vacunados con sCPD9+sCPD9 y mRNA+sCPD9. La consolidación del parénquima respiratorio y la alveolitis fueron menos graves en ambos grupos reforzados con sCPD9. La remodelación epitelial metaplásica fue particularmente pronunciada en animales vacunados con Ad2-Ad2. La endotelialitis se redujo fuertemente en grados similares en todos los grupos reforzados. Barras de escala = 20 μm para cada columna.

Datos fuente

( a ) Proyecciones bidimensionales de transcriptomas unicelulares utilizando UMAP de células sanguíneas del experimento prime-boost. Las células están coloreadas por tipos de células como se indica en función de los genes marcadores conocidos. ( b, d ) Números de componentes celulares por ml de sangre para el experimento de refuerzo. ( c ) Porcentaje de componentes celulares sanguíneos para el experimento de refuerzo. ( b - d ) Se muestran ANOVA unidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett contra el grupo simulado por tipo de célula. Media ± SEM, los símbolos representan hámster individual. nsCPD9 + sCPD9 = 3, nmRNA + sCPD9 = 3, nmRNA + mRNA = 3, nAd2 + Ad2 = 3, nmock + simulacro = 4 hámsteres individuales como símbolos. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01 y ∗∗∗ < 0,001.

Datos fuente

(a) Puntuaciones semicuantitativas de hallazgos histopatológicos en hámsteres que recibieron la vacunación primaria (fila superior) o la vacunación primaria y de refuerzo (fila inferior). El área afectada por el daño de la mucosa debido a la infección por SARS-CoV-2 se muestra en porcentaje. La puntuación de daño tisular tiene en cuenta la exfoliación epitelial, la necrosis, la apoptosis, los restos celulares y la pérdida de cilio. La presencia de neutrófilos y linfocitos en los cornetes nasales se evalúa mediante la puntuación de células inmunitarias. Centro (mediana), Caja (percentil 25 a 75) y bigotes (Min a Max). Se realizaron ANOVA de dos vías y la prueba de comparación múltiple de Tukey para la evaluación estadística. N = 5 hámsteres individuales por grupo. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. ( b ) Proyecciones bidimensionales de transcriptomas unicelulares utilizando UMAP de células de tejido nasal del experimento principal. La coloración indica los tipos de células anotados en función de los genes marcadores conocidos.

Datos fuente

(a) Diseño de un experimento de prueba de principio de transmisión hacia adelante. Los hámsteres se vacunaron con un LAV de sCPD9 eliminado en el sitio de escisión de furina o la vacuna de ARNm de BNT162b2 en un programa de inducción y refuerzo. La infección de desafío se realizó con SARS-CoV-2 variante B.1, los animales vacunados y desafiados convivieron con contactos ingenuos a partir de las 24 horas posteriores al desafío durante 6 días consecutivos. (b) Carga de ARN del SARS-CoV-2 en hisopos orales diarios tomados de excrementos vacunados durante el período de covivienda. N = 3 por grupo, media ± SEM. ANOVA de dos vías, prueba de comparaciones múltiples de Tukey. (c) carga de ARN de SARS-CoV-2 en los pulmones y (d) hisopos faríngeos al terminar los animales vacunados. N = 3, media ± SEM, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey. (e) Carga de ARN del SARS-CoV-2 en hisopos orales diarios tomados de animales de contacto ingenuos durante el período de alojamiento compartido. N = 3, media ± SEM. ANOVA de dos vías, prueba de comparaciones múltiples de Tukey. (f) Carga de ARN del SARS-CoV-2 en los pulmones y (G) hisopos faríngeos al terminar los animales de contacto ingenuos. N = 3, media ± SEM, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. El panel a fue creado con BioRender.com.

Datos fuente

Figs suplementarias. 1–13, Métodos y referencias.

Fuente de datos estadísticos para cifras complementarias.

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Nouailles, G., Adler, JM, Pennitz, P. et al. La vacuna viva atenuada sCPD9 provoca una inmunidad sistémica y mucosa superior a las variantes del SARS-CoV-2 en hámsteres. Nat Microbiol 8, 860–874 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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Recibido: 30 junio 2022

Aceptado: 01 de marzo de 2023

Publicado: 03 abril 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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